STERILISASI

A.    Tujuan praktikum

Mampu melakukan sterilisasi peralatan dan medium yang sering digunakan dalam praktikum mikrobiologi.

B.     Dasar Teori

Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi persiapan (dan berlindung dari kontaminasi) dari kultur media mikroorganisme dan menerapkan prinsip kerja dalam memanipulasi kultur murni.(R.Y. Stanier, 1976)

Praktikum di laboratorium dapat melibatkan penggunaan mikroorganisme yang berbahaya. Fasilitas bisa dibangun untuk meminimalkan resiko bagi para peneliti yang sedang melakukan praktikun terhadap organism tertentu, seperti asap kerudung, sarung kotak-kotak dan keadaan khusus, seluruh kamar/ ruangan yang dirancang supaya mengandung mikroba. Disamping kultur/ media mikroorganisme, apapun yang berkaitan dengan organism harus dibuang dengan hati-hati seperti  : jarum suntik, kandang hewan, mikroskop slide, alat ukur, dan pipet. Cara untuk mengatasinya adalah dengan sterilisasi dengan menggunakan Autoclave, dan pembakaran pada suhu tinggi(di oven).(http://www.e-notes.com, 30/10/09)

 Sterilisasi yang benar-benar adalah menghilangkan semua bentuk kehidupan mikroba. Metodenya adalah Autoclave, flaming, mendidih, pemutih, menggosok alcohol, kimia, dan piercing di lapangan. Autoclave Umumnya dianggap sebagai satu-satunya bentuk sterilisasi yangs sesuai untuk sebuah tempat modifikasi tubuh, meskipun beberapa volume rendah studio dapat menggunakan sterilisasi kimia. Sterilisasi autoclave melalui kombinasi tekanan dan panas. Meskipun dalam prosesnya membutuhkan waktu yang lumayan lama.(http://www.wikimedia.com, 30/10/09)

autoklave biasanya menggunakan uap dipanaskan sampai 121 ° C atau 134 ° C. Untuk mencapai sterilitas, holding waktu paling lama 15 menit pada 121 ° C atau 3 menit pada 134 ° C .(http://www.wikipedia.com, 30/10/09)

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik, dan kimiawi. (Fediaz,1992)

Ø  Sterilisasi secar mekanik (filtrasi) manggunakan suatu jaringan yang berpori sangat kecil (0,22 mikron atau 0,45 mikron ) sehingga mikroba tertahan pada jaring tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi sehingga bahan yang peka panas, misalnya enzim dan antibiotik.

Ø  Sterilisasi secar fisik yang dilakukan dengan pemansan dan penyinaran (Ferdiaz,1992)

a)      Pemanasan

Pemijaran dengan api langsung : membakar alat pada api secara langsung. Contoh alat: jarum oose, inokulum, pinset, batang L.

Panas kering :pemanasan dengan kira-kira suhu 60-180 derajat selcius. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca. Misalnya: erlenmeyer, tabung reaksi, dll.

Uap air panas : konsep ini bahannya lebih banyak mengandung air menggunakan metoe ini supaya tidak terjadi dehidrasi.

Uap air panas bertekanan : menggunakan autoclave.

b)      penyinaran dengan UV

sinar ultra violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior safety cabinet dengan lampu UV.

Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyaw desinfektan antara lain alkohol.

1.       sterilisasi secar mekanik

yaitu filtrasi /penyaringan adalah proses sterilisasi yang dilakukan pada suhu kamar, sterilisasi dengan penyaringan digunakan untuk bahan yang peka terhadap panas, misalnya: serum, urea, dan enzim.(lay dan hastowo,2002)

Dengan cara penyaringan larutan  atau suspensi dibebaskan dari semua organisme hidup dengan cara melakukammua lewat saringan dengan ukuran yang lebih besar di wadah yang steril.(hadioetomo,1985)

2.       sterilisasi secara fisik

sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan cara pemanasan dan penyinaran.

a)      pemanasan basah

pemanasan basah adalah sterilisasi panas yang digunakan bersama-sama dengan uap air. Pemanasan basah biasanya dilakukan dengan di dalam autoklaf atau sterilisasi uap yang mudah diangkat dengan menggunakan uap air jenuh  bertekanan pada suhu 121 derajat celcius selama 15 menit.(hadioetomo,1985)

cara pemanasan basah dapat membunuh jasad renik atau mokroorganisme , terutama karena panas basah dapat menyebabkan denaturasi protein, termasuk enzim-enzim di dalam sel.(ferdiaz,1992)

b)      pemanasan kering

apabila dibandingkan dengan pemanasan  basah, pemanasan kering kurang efisien dan membutuhkan suhu yang lebih tinggi. Hal ini disebabkan karen a tanpa kemlambaban maka tidak ada yang panas inten .(hadioetomo,1985)

keuntungan dari pemanasan kering adalah tidak adanya uap air  yang membasahi bahan atau alat yang disterilkan .(lay dan hastowo, 1992)

c)       pemanasan bertahap

pemanasan bertahap dilakukan apabila media atau bahan kimia tahan terhadap uap 100 derajat celcius.(laya dan hastowo,1992)

d)      perebusan

perebusan adalah pemanasan di dalam air mendidih atau uap air pada suhu 100 derajat selsius selama beberapa menit (ferdiaz, 1992)

e)      radiasi ionisasi

adalah radiasi yang mengandung energi  jauh lebih tinggi daipada sinar UV . oleh karena itu, memepunyai daya desinfektan yang lebih kuat. Salah satu contoh radiasi ionisasi adalah sinar gamma yang dipancarkan dari kobalt-10 radiasi dengan sinar gamma dapat menebabkan ion bersifat hiperaktif.(laya dan hastowo, 1992)

f)       radiasi secara ultraviolet

sinar UV dengan panjang gelombang yang pendek memiliki daya antimikrobial yang sangat kuat. Kerusakan tersebut dapat diperbaiki bila disinari dengan berkas yang mempunyai gelombang yang lebih panjang.(lay dan hastowo, 1985)

3.       sterilisasi secara kimiawi

sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.(lay dan hastowo, 1992)

bahan yang menjadi rusak bila disterilkan pada suhu yang tinggi dapat secar kimiawi dengan menggunakan gas.

Bahan kimia yang sering digunakan antara lain:

-          alkohol

-          klor

-          yodium

-          formaldehida 8%

-          gas etilen oksida

4.       sterilisasi basah

teknologi pengemasan aseptik untuk minuman yang sensitif terhadap asam kini telah dikembangkan. Konsep aseptis ini menggunakan larutan PPA (paraacetic acid) sebagai medium sterilisasi , isolator mikrobial untuk pengendali lingkungan sistem aseptik ini digunakn dalam industri minuman.

A.    Alat dan Bahan

No	Alat	Bahan
1	Autoclave	Kapas
2	Oven	Kertas
3	Tabung reaksi	Karet gelang
4	Cawan petri	Kassa
5	Pengaduk	Deterjen
6	Jarum oze
7	Elemeyer

D. CARA KERJA

 

 

Autoclave dibuka bila manomater telah menunjukan angka nol

                                                                                                                                  

E. Pengamatan

Semua alat yang ingin disterilkan disiapkan dengan baik dan dibagi rata tiap kelompok, metode yang digunakan adalah menggunakan Autoclave dengan suhu tertentu yaitu 121°C/1 atm. Alat dimasukan kedalam oven, oven yang disediakan ada dua yaitu oven listrik dan oven biasa.

 

(a)                                        (b)                                                         (c)

Gambar1. (a) pada saat alat yang ingin disterilkan dimasukkan dalam oven. (b) oven listrik yang digunakan. (c) oven biasa yang harus dipanaskan dengan menggunakan kompor.

Suhu pada oven harus diatas suhu 100°C dengan waktu sekitar 5-10 menit agar semua mikroorganisme didalamnya mati, setelah 5-10 menit alat dikeluarkan ditutup dengan kapas dan kassa dan dibungkus dengan kertas ditambah karet gelang, masukkan kedalam autoclave dan autoclave dipanaskan dengan waktu 10 menit suhu optimumnya 121°C, buka-tutup jika sampai batas suhu optimum, setelah 10 menit buka dengan catatan manometer menunjukan angka nol agar tidak terjadi hal tidak yang diinginkan. Dan masukan lagi alat-alat yang ingin disterilkan ke dalam oven dengan aturan yang sama dengan aturan oven yang pertama kali dilakukan.

manometer

(a)   

Pipa uap

                                                          (b)

Gambar 2. (a) autoclave yang dipanaskan hingga suhu optimum 121°C selama 10 menit dengan system buka-tutup.(b) suhu optimum 121°C pada manometer yang mengeluarkan asap dari lubang pipa uap.

(a)                                                                  (b)

Gambar 3. (a)  cara pembukaan autoclave ketika menometer menunjukan angka nol. (b) alat-alat steril dari autoclave yang sudah steril.

Dengan cara diatas bisa dikatakan alat-alat yang disterilkan sudah steril dan siap digunakan lagi dalam penelitian-penelitian didalam laboratorium mikrobiologi.

F. Pembahasan

Dalam laboratorium mikrobiolgi terdapat banyak sekali penelitian-penelitian yang menyangkut dengan mikroorganisme. Alat yang digunakan pun dipakai berulang-ulang kali tak tahu apakah masih ada mikroorganisme yang masih tersisa di alat-alat tersebut atau tidak, walaupun sudah dicuci dengan anggapan bersih. Agar aman dari segala mikroorganisme maka dikenal sterilisasi alat-alat bahan praktikum, caranya banyak salah satunya yang paling umum digunakan yaitu dengan menggunakan Autoclave,

Prinsip cara kerja autoklaf

Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 121⁰C. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 121⁰C dan tekanan 15 lb/in² (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 121⁰C atau 249,8 ⁰F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 100⁰C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 121⁰C. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 121⁰C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 121⁰C dan tekanan 15 psi selama 15 menit.

Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi.

Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik.

Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah :

- Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim

- Paelarut organik, seperti fenol

- Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS

Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :

- Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat

- Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain.

- Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar

- Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf

- Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0

Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya, sisa ruang dibirkan kosong. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit.

DAFTAR PUSTAKA

Stainer, R.Y. 1976.What is microbiologi?.france: institute Pasteur

h.adioctomo, RS.1993.Mikrobiologi dasar dalam praktikum.Jakarta:gramedia.

Dwidjoseputro.P.1994.dasar-dasar Mikrobiologi.Jakarta:Djambatan.

.(http://www.wikipedia.com, waktu akses 29/10/09 jam

(http://www.e-notes.com, waktu akses 29/10/09 jam 12.00

Posted in: Semester 2