PERCOBAAN VII INDUKSI b-GALAKTOSIDASE

VII.1 PENDAHULUAN

            Pengendalian metabolism pada dasarnya adalah pengendalian aktivitas atau sintesis enzim-enzim kunci pada jalur metabolism. Salah satu contoh klasik pengendalian sintesis enzim adalah lac-operon.

            Pada system ini produksi b-galaktosidase (lactase) diinduksi oleh adanya laktosa dalam medium pertumbuhan.

            Dalam percobaan ini, akan dilakukan induksi dan pengukuran aktivitas b-galaktosidase. ONPG digunakan sebagai pengganti laktosa. Setelah perusakan membrane sel oleh toluene, ONPG yang tidak berwarna ditambahkan dan berdifusi ke dalam sel. Adanya aktivitas b-galaktosidase ditunjukkan adanya perubahan warna (menjadi kuning) dari ONP.

VII.2 PERCOBAAN

Alat:

1.      Tiga buah tabung reaksi bertutup

2.      Jarum ose

3.      Pipet ukur 1 mL

4.      Pipet tetes

5.      Gelas ukur 5 mL

6.      Rak tabung reaksi

7.      Filler

8.      Pembakar spiritus

9.      Water bath

10.   Hair dryer

11.   Spektofotometer

12.   Goggles

Bahan:

1.      Suspense sel Escherichia coli yang mengandung gen lacZ (b-galaktosidase) yang ditumbuhkan dalam Nutrient Broth (Kaldu nutrient) yang mengandung 0,1 gram laktosa/mL kaldu (24-48 jam sebelum digunakan).

2.      Medium pertumbuhan: nutrient broth (NB, Kaldu nutrient).

Komposisi Nutrient Broth: beef extract (Difco) 0,3 %, bacto peptone (Difco) 0,5 %, NaCl (Merck) 0,5 %.

3.      Medium pertumbuhan Nutrient Broth yang mengandung 0,06 gram laktosa dan 0,04 gram glukosa/mL kaldu.

4.      Etanol 70% (teknis) dan cuplikan air

5.      Larutan ONPG (orto-nitrofenil-b-D-galaktosida) dalam buffer Z, yang harus disiapkan “segar” sebelum digunakan.

6.      Toluene

Prosedur:

1.      Pipet (dengan filler) 0,1 mL suspense mikroba ke dalam masing-masing tabung reaksi secara aseptic. (Simpan pipet ‘habis pakai’ dalam tempatnya)

2.      Pada tabung “control”, masukkan 0,1 mL kaldu Nutrien.

3.      Pada tabung “glukosa”, masukkan 0,1 mL kaldu Nutrien yang mengandung glukosa.

4.      Pada tabung “laktosa”, masukkan 0,1 mL kaldu Nutrien yang mengandung laktosa.

5.      Beri label pada ketiga tabung reaksi bertutup.

6.      Tambahkan 1 tetes toluene ke dalam masing-masing tabung reaksi, kocok kuat, sehingga tercampur rata.

Lakukan prosedur selanjutnya di lemari asam.

7.      Uapkan toluene dengan menggunakan ‘hair dryer’ di lemari asam sehingga tidak terlihat lagi lapisan minyak dipermukaan campuran.

8.      Tempatkan sampel dalam water bath 35-37°C.

9.      Tambahkan 2 mL larutan ONPG ke dalam masing-masing tabung, catat waktunya.

10.   Ukur Optical Density (OD) dari masing-masing sampel pada 420 nm (440 nm) tiap selang waktu 10 menit sampai tidak terjadi lagi perubahan warna.  

PERHATIAN!!!

Setelah selesai bekerja dengan mikroba, jangan lupa untuk mensterilisasi kembali meja kerja, semua peralatan dan bahan’habis pakai’ yang digunakan. Buang sampah pada tempat khusus (yang mengandung disinfektan)!!!

Toluene bersifat mudah terbakar, dan uapnya berbahaya, hindari kontak dengan kulit dan mata. Gunakan goggles!

Tugas:

Gambarkan kurva antara OD₄₂₀ terhadap waktu.

VII.3 TUGAS PENDAHULUAN

1.      Apakah yang dimaksud dengan gen structural dan gen pengendali?

2.      Jelaskan arti enzim induktif dan enzim konstitutif!

DAFTAR PUSTAKA

Bollag, D. M., Rozycki, M. D. and Eldelstein, S. J. 1996. Protein Methods, 2^nd ed., A. John Wiley & Sons, Inc., Pub., New York.

Boyer, R. F. 1993. Modern Experimental Biochemistry, 2^nd ed., The Benyamin/Cummings Publishing Company, Inc., California.

Lehninger, A. L. 1982. Principles of Biochemistry, Worth Publisher, Inc., New York.

NCBE. 2000. Illuminating DNA, version 1.0.

Stryer, L. 1998. Biochemistry, 4^th ed., W. H. Freeman and Company, New York.

Posted in: Biokimia II