PERCOBAAN V PENENTUAN TRANSAMINASE GLUTAMAT-PIRUVAT DARI SERUM DARAH

V.1  PENDAHULUAN

            Dalam metabolism asam amino, gugus α-amino dari ke-20 asam L-amino yang biasa dijumpai pada protein akan dipindahkan pada tahap tertentu dalam degradasi oksidatif asam amino tersebut. Pemindahan gugus α-amino dari kebanyakan asam L-amino dikatalisa oleh enzim yang disebut transaminase atau aminotransferase. Pada reaksi ini, gugus α-amino dipindahkan secara enzimatik ke atom karbon α pada α-ketoglutarat, sehingga dihasilkan asam  α-keto, sebagai analog dengan asam amino yang bersangkutan. Reaksi ini juga menyebabkan aminasi  α-ketoglutarat, membentuk L- glutamate:

Asam L-α-amino + α-ketoglutarat asam α-keto + L-glutamat

                Kebanyakan enzim transaminase bersifat spesifik bagi α-ketoglutarat sebagai molekul penerima gugus amino. Namun demikian, enzim tersebut tidak terlalu spesifik bagi substratnya, yaitu asam L-amino yang memberikan gugus aminonya. Berikut ini beberapa transaminase yang paling penting, yang dinamakan sesuai dengan molekul pemberi aminonya:

L-alanin + α-ketoglutarat  piruvat + L-glutamat

L-aspartat+ α-ketoglutarat  oksaloasetat + L-glutamat

L-leusin + α-ketoglutarat  α-ketoisokaproat + L-glutamat

L-tirosin + α-ketoglutarat  p-hidroksifenilpiruvat + L-glutamat

            Hati, ginjal, jantung dan otot-otot mengandung banyak transaminase glutamate-oksaloasetat (TGO) yang juga terkenal sebagai aspartat aminotransferase dan transaminase glutamate-piruvat (TGP) atau alanin aminotransferase. Serum dalam keadaan normal juga menunjukkan adanya aktivitas enzim tersebut, tetapi rendah. Hanya apabila ada kerusakan sel pada jaringan-jaringan tersebut maka enzim-enzim intraseluler tadi akan keluar dari sel dan masuk ke dalam darah. Kenaikan aktivitas TGO dan TGP serum dapat dijumpai pada macam-macam penyakit yang menyangkut jaringan organ-organ tertentu.

V.2  PERCOBAAN

Alat:

1.      Tabung reaksi

2.      Batang pengaduk

3.      Spektrofotometer

4.      Kuvet

5.      Pipet tetes

6.      Water bath

Bahan:

1.      Buffer fosfat pH 7,4 (11,3 g Na₂HPO₄; 2,7 g KH₂PO₄ dalam 1L H₂O)

2.      Substrat (200 mM asam d-L-alanin; 2 mM asam α-ketoglutarat)

3.      Larutan standar piruvat (4mM)

4.      Larutan 2,4-dinitrofenilhidrazin (19,8 mg dinitrofenilhidrazin dalam 10 mL HCl pekat)

5.      Larutan 0,4 N NaOH

6.      Serum

Prosedur:

1.      Pipet 0,5 mL substrat kedalam tabung reaksi dan inkubasikan ke dalam water bath 37°C selama 3 menit.

2.      Tambahkan 0,1 mL serum, campurkan dengan pelan dan inkubasi selama tepat 60 menit.

3.      Keluarkan tabung tersebut dari incubator dan masukkan segera 0,5 mL larutan dinitrofenilhidrazin (DNFH), kocok dengan pelan.

4.      Sebagai control, campurkan 0,5 mL substrat dengan 0,5 mL larutan DNFH. Setelah tercampur, tambahkan 0,1 mL serum.

5.      Sebagai blanko, campurkan 0,5 mL substrat dengan 0,1 mL air dan 0,5 mL larutan DNFH.

6.      Sebagai standar, campurkan 0,1 mL larutan standar piruvat dengan 0,4 mL substrat, 0,1 mL air dan 0,5 mL larutan DNFH.

7.      Biarkan DNFH pada semua tabung bereaksi pada suhu kamar selama 20 menit.

8.      Kemudian tambahkan 5 mL 0,4 N NaOH. Campurkan dengan baik dan biarkan pada suhu kamar selama 10 menit.

9.      Ukur nilai absorbansinya pada l=510 nm.

Perhitungan

Piruvat yang terbentuk selama 60 menit oleh 0,1 mL serum adalah:

(T-K)/(S-B) x 4 mM piruvat

Dimana:

T = serapan untuk zat yang diperiksa

K = serapan untuk control

S = serapan untuk standar

B = serapan untuk blanko

Maka piruvat yang terbentuk per menit oleh perliter serum:

(T-K)/(S-B) x 4 x 1/1000 x 0,1 x 1/60 x 1000/0,1 = (T-K)/(S-B) x 67μmol

Batas tertinggi untuk harga normal adalah 23 mmol piruvat per menit per liter serum.

Tugas

Tentukan jumlah piruvat yang terbentuk.

Pertanyaan

1.      Bandingkan hasil perhitungan dari percobaan dengan harga normal!

2.      Mengapa/apa maksud dilakukan pengujian terhadap larutan control, blanko dan standar?

3.      Jelaskan dengan disertai reaksi-reaksi kimianya penentuan transaminase glutamate-oksaloasetat secara kolorimetri dengan 2,4-dinitrofenilhidrazin!

4.      Sebutkan beberapa penyakit yang menyebabkan kenaikan aktivitas transaminase glutamate-oksaloasetat serum!

V.3  TUGAS PENDAHULUAN

1.      Asam amino apa saja yang terlibat dalam percobaan yang akan dilakukan? Tulis secara lengkap persamaan reaksi enzimatis transaminasi yang terjadi!

2.      Apa fungsi zat-zat dalam percobaan berikut ini:

a.     d-L-alanin

b.    piruvat

c.     serum

d.    2,4-dinitrofenilhidrazin

e.     NaOH

f.      α-ketoglutarat

3.      Transaminasi adalah reaksi yang paling umum dialami oleh hamper semua asam amino bebas. Sebutkan asam amino apa saja yang tidak terlbat dalam reaksi aminotransferase! 

Posted in: Biokimia II