PERCOBAAN III HIDROLISA GLIKOGEN DENGAN ENZIM

III.1 PENDAHULUAN

            Enzim α-amilase saliva mengkatalisis hidrolisa ikatan 1,4-glikosidik yang terdapat di bagian dalam suatu molekul glikogen atau pati. Enzim α-amilase ludah manusia mengandung 1 mol Ca²⁺ per mol enzim proteinnya. Ikatan Ca²⁺ ini diperlukan dalam aktivitas enzim tersebut. Aktivitas enzim α-amilase juga memerlukan anion-anion, seperti Cl^-, Br^-, dan I^-. Hidrolisa sempurna oleh α-amilase akan tercapai jika substrat (glikogen) yang digunakan memiliki konsentrasi tak jenuh dan rendah, sedangkan enzim yang digunakannya memiliki konsentrasi yang tinggi.  

III.2 PERCOBAAN

Alat:

1.      Tabung reaksi

2.      Rak tabung reaksi

3.      Gelas ukur 10 mL

4.      Pipet tetes

5.      Neraca analitik

6.      Water bath

7.      Spektofotometri

8.      Kuvet

Bahan:

1.      Glukosa 0,25 M

2.      Glikogen

3.      K-fosfat buffer pH 6,9 25μmol

4.      NaCl 10μmol

5.      Saliva

6.      Reagen Nelson

7.      Arsenol Molibdate

Prosedur:

A.     PENGUJIAN SAMPLE

1.      Siapkan 7 buah tabung reaksi (Tabung 1 = larutan kontrol).

2.      Masukkan 0,1 mL K-Fosfat buffer pH 6,9 (25μmol) dan 0,1 mL NaCl (10μmol) ke dalam masing-masing tabung reaksi.

3.      Encerkan larutan di atas sampai volume larutan 0,9 mL.

4.      Larutkan 15 mg glikogen dalam 5 mL H₂O, kemudian pipet sebanyak 0,1 mL dan masukkan ke dalam setiap tabung reaksi yang telah berisi larutan di atas.

5.      Tambahkan 1 mL reagen Nelson hanya pada tabung 1 (larutan kontrol). 

6.      Encerkan 0,5 mL saliva dengan air (0,1 mL saliva/10 mL air).

7.      Tambahkan 0,1 mL saliva yang telah diencerkan kedalam setiap tabung reaksi yang telah diisi campuran di atas.

8.      Tempatkan semua tabung reaksi dalam water bath 25°C.

9.      Inkubasi semua larutan  dalam tabung reaksi:

Tabung 1   : t=0 menit

Tabung 2   : t=3 menit

Tabung 3   : t=6 menit

Tabung 4   : t=9 menit

Tabung 5   : t=15 menit

Tabung 6   : t=20 menit

Tabung 7   : t=25 menit

10.   Tambahkan 1 mL reagen Nelson ke dalam tabung 2-7.

11.   Panaskan kembali semua tabung, kemudian dinginkan.

12.   Tambahkan 1 mL arsenolmolibdat kedalam semua tabung reaksi.

13.   Ukur absorbansi semua larutan dalam tabung reaksi menggunakan spektofotometri pada l=660 nm.

14.   Gambarkan nilai absorbansi (A) terhadap kurva waktu (t)dan tentukan nilai Absorbansi maksimum.

B.     PEMBUATAN KURVA KALIBRASI STANDAR

1.      Siapkan 6 buah tabung reaksi.

2.      Tabung 1   : 1 mL air

Tabung 2   : 0,2 mL glukosa + 0,8 mL air

Tabung 3   : 0,4 mL glukosa + 0,6 mL air

Tabung 4   : 0,6 mL glukosa + 0,4 mL air

Tabung 5   : 0,8 mL glukosa + 0,2 mL air

Tabung 6   : 1 mL glukosa

3.      Tambahkan ke dalam semua tabung reaksi 1 mL reagen Nelson dan 1 mL arsenolmolibdat.

4.      Encerkan masing-masing larutan dalam semua tabung reaksi sampai volume 10 mL.

5.      Ukur absorbansi semua larutan yang telah diencerkan dalam setiap tabung reaksi pada l=660 nm dengan spektofotometri.

6.      Gambarkan kurva konsentrasi glukosa standar (C) terhadap nilai absorbansi (A).

7.      Tentukan konsentrasi glukosa dengan mensubstitusi nilai Absorbansi maksimum ke dalam persamaan garis yang diperoleh dari kurva nilai absorbansi terhadap konsentrasi glukosa.

8.      Tentukan mol glukosa dari percobaan yang telah dilakukan (dalam satuan μmol).

Tugas:

Tentukan mol reducing ekuivalen dari α-amilase per mg glikogen (dalam satuan = μmol/mg).

III.3 TUGAS PENDAHULUAN

1.      Jelaskan setiap komponen yang terdapat dalam pati!

2.      Gambarkan rumus struktur Arsenomolibdate dan jelaskan reaksi yang terjadi ketika arsenolmolibdate ditambahkan kedalam campuran!

3.      Zat-zat apa saja yang digunakan dalam campuran Nelson?

Posted in: Biokimia II