PERCOBAAN II KINETIKA REAKSI ENZIM TRIPSIN

II.1  PENDAHULUAN

            Tripsin adalah enzim kelompok serin protease yang memotong protein pada C-terminal antara lisin dan arginin. Tripsin merupakan endopeptidase (memotong ikatan peptide bagian dalam). pH optimal tripsin adalah 8 dan suhu optimalnya 50°C.

            Kinetika reaksi enzim tripsin dapat dilakukan dengan menentukan nilai laju reaksi maksimum dan konstanta Michaelis-Menten. Substrat yang digunakan dalam percobaan ini adalah kasein. Kasein mengandung peptide prolin, bersifat relative hidrofobik, tidak larut dalam air, dan ditemukan dalam senyawa dengan suspensi.

Kasein + H₂O                asam amino

            Kasein yang dihidrolisis dengan bantuan katalis enzim tripsin akan menghasilkan fragmen-fragmen asam amino. Pengendapan protein dilakukan dengan penambahan TCA (Tricarboxilate Acid). Supernatant (TCA-filtrat) diukur absorbansinya setelah dinetralkan oleh basa dan diberi reagen Folin-Ciocalteu.

II.2  PERCOBAAN

Alat :

1.      Tabung reaksi

2.      Rak tabung reaksi

3.      Batang pengaduk

4.      Pipet tetes

5.      Incubator

6.      Stopwatch

7.      Gelas ukur 10 mL

8.      Gelas kimia 50 mL

9.      Thermometer

10.   Tabung Valcon

11.   Sentrifuga

12.   Spektrofotometri

13.   Kuvet

Bahan :

1.      Larutan Kasein 2% (b/v)

2.      Larutan Tripsin

3.      Buffet fosfat

4.      Larutan TCA 20%

5.      Larutan NaOH 0,5 M

6.      Reagen Folin-Ciocalteu

7.      Kertas Saring

Prosedur :

A.     Waktu Inkubasi t = 20 menit

1.      Siapkan 5 buah tabung reaksi.

2.      Masukkan kasein kedalam tabung reaksi.

Tabung I               : 0,1 mL

Tabung II              : 0,5 mL

Tabung III             : 1,0 mL

Tabung IV                         : 3,0 mL

Tabung V               : 5,0 mL

3.      Inkubasi selama 5 menit dalam incubator 35°C.

4.      Tambahkan buffer fosfat dan aduk perlahan (Volume buffer fosfat = 6 mL – volume kasein).

5.      Tambahkan 1 mL larutan tripsin dan aduk perlahan, catat waktu.

6.      Inkubasi campuran selama 20 menit dalam incubator 35°C.

7.      Tambahkan 3 mL TCA 20% dan aduk dengan kuat.

8.      Diamkan selama 30 menit dalam air es.

9.      Masukkan campuran kedalam tabung Valcon.

10.   Sentrifugasi campuran selama 10 menit.

11.   Saring campuran dan gunakan filtrat untuk uji ANSON.

B.     Waktu Inkubasi t = 0 menit

1.      Siapkan 5 buah tabung reaksi (jumlah masing-masing zat pada setiap tabung reaksi sama dengan tahap A).

2.      Masukkan larutan buffer fosfat dan 1 mL larutan enzim tripsin kedalam tabung reaksi.

3.      Tambahkan 3 mL TCA 20%.

4.      Inkubasi campuran selama 30 menit dalam incubator 35°C.

5.      Tambahkan larutan kasein.

6.      Diamkan selama 30 menit dalam air es.

7.      Masukkan campuran kedalam tabung Valcon dan sntrifugasi selama 10 menit.

8.      Saring campuran hasil sentrifugasi.

9.      Gunakan filtrat yang diperoleh untuk uji ANSON.

C.     Metode ANSON

1.      Masukan 2 mL filtrat hasil sentrifugasi kedalam gelas kimia.

2.      Tambahkan 4 mL NaOH 0,5 M.

3.      Tambahkan 1 mL reagen Folin-Ciocalteu

4.      Aduk campuran dan diamkan selama 10 menit pada suhu kamar.

5.      Tentukan serapannya (nilai absorbansi) pada l=650 nm dengan menggunakan spektrofotometri.

Tugas :

1.      Tentukan nilai laju reaksi maksimum dari kinetika reaksi enzim tripsin!

2.      Tentukan konstanta Michaelis-Menten (K_M) dari kinetika reaksi enzim tripsin!

II.3  TUGAS PENDAHULUAN

1.      Jelaskan faktor-faktor apa saja yang mempengaruhi laju reaksi enzim!

2.      Turunkan persamaan kinetika enzim Michaelis-Menten dengan menggunakan pendekatan teori keadaan tunak (steady state)!

3.      Tentukanlah nilai K_M pada saat V₀ = ½ V_max!

4.      Jelaskan istilah-istilah di bawah ini:

a.     Unit Aktivitas

b.    Aktivitas Spesifik

c.     Aktivitas Total 

Posted in: Biokimia II