LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PEWARNAAN MAJEMUK ~ Chemistry Of Drizzle

Judul : PEWARNAAN MAJEMUK

Hari/tgl : Rabu, 24-12-2009

Tujuan : - Mampu melakukan pewarnaan bakteri dengan beberapa macam zat warna dengan metode gram.

PENDAHULUAN :

Pewarnaan majemuk ini digunakan lebih dari satu macam bahan ca. Dengan cara ini bahan-bahan cat yang dipakai ada kalanya terpisah dan ada kalanya tercampur dan digunakan dalam satu larutan. Dua macam pengecetan yang terpenting dari golongan ini adalah pengecetan gram dan pngecetan tahan asam. (Koes Irianto.2006 :60)

Pewarnaan gram masih merupakan salah satu cara yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyaknya bakteri. Terutama sangat berarti dalam laboratorium diaguastik rumah salut karena informasi yang diperoleh dari pengamatan spesimen yang diwarnai dengan pewarna gram dengan cepat dapat memberi petunjuk akan organisme penyebab suatu infeksi. (Michael.J. Pekzar dan E.C.S. Chan. 2006 :85)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Selasa, 22-12-2009

(http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram)

Teknik pengecatan Gram dikembangkan oleh Hans Christian Gram (dokter berkebangsaan Denmark, 1884). Pengecatan Gram merupakan salah satu langkah awal mengidentifikasi sel bakteri yang memisahkan bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna merah)

Pengecatan gram termasuk pengecatan diferensial yang digunakan untuk membedakan bakteri gram negative dan bakteri gram positif. Pada pengecatn ini digunakan 3 jenis bakteri yaitu Bacillus cereus, Salmonella typii dan Eshericia coli.. Pengecatan ini menggunakan 4 jenis larutan yaitu Kristal violet sebagai cat utama, larutan iodine sebagai pengintensifan cat utama, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai cat penutup. Berdasarkan percobaan diperoleh Bacillus cereus dan Salmonella typii bersifat gram positif yang berarti bakteri dapat mengikat dengan kuat cat utama cristal violet berwarna ungu, pada saat bakteri Gram positif ditambahkan dengan kristal violet maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel, dengan pemberian larutan lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel, pemberian alkohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Sedangkan bakteri Eschericia coli bersifat gram negative karena tidak dapat mengikat kuat cat utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin.

Table perbedaan Sifat Gram Positif dan Sifat Gram Negatif

Perbedaan	Sifat Gram Positif	Sifat Gram Negatif
Komposisi kandungan lipid	Rendah	Tinggi
Ketahanan terhadap penisilin	Lebih sensitive	Lebih tahan
Penghambatan warna	Lebih dihambat	Kurang dihambat
Ketahanan terhadap fisik	Lebih tahan	Kurang tahan
Kebutuhan nutrium	kompleks	Relative

(http://firmangalung07.blogspot.com/2009/08/teknik-pewarnaan-mikroorganisme.html) Selasa, 22-12-2009

Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru.

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek. Selasa, 22-12-2009

(http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gram-negatif/)

Setiap metode apapun lebih baik jika dibarengi dengan kontrol kualitas sehingga hasil yang didapat tidak diragukan lagi dan analisis letak kesalahan dapat dilakukan. Untuk mengetahui hasil pewarnaan gram dengan benar diperlukan bakteri kontrol. Bakteri ini berfungsi untuk mengetahui baik atau tidaknya pewarna atau bahan-bahan lain, bisa juga untuk mengecek metode yang dilakukan telah sesuai prosedur atau belum. Masalah dijumpai jika semua itu tidak ada, artinya dengan dana terbatas dan segala keterbatasan yang ada, seseorang dibingungkan dengan warna ungu atau merah jingga dari bakteri X. Batas kedua warna ini semakin abu-abu bila yang melakukan adalah pemula. Latar belakang inilah yang membuat tulisan picisan ini muncul dan mungkin telah banyak sekali orang yang telah memikirkannya.

Simpel saja kita hanya membutuhkan salah satu bakteri kontrol yang bersifat gram +/- untuk dibandingkan dengan bakteri uji. Beberapa literatur menyarankan untuk menggunakan bakteri flora normal mulut di langit-langit atas sebagai kontrol (banyak dijumpai gram +/-). Namun kelemahannya adalah sulit membedakan antara sel bakteri, sisa makanan, sel epitelium, kotoran lain atau serpihan tusuk gigi, dan perlu diingat jumlah bakteri yang ada tidak pasti dan sedikit. Solusinya adalah memanfaatkan probiotik kultur murni yang banyak dijual di pasaran. Probiotik dalam botol ini pastinya berisi genus yang sesuai dengan yang tertera di kemasan. Selain untuk menyehatkan pencernaan dapat juga digunakan sebagai kontrol gram +.

Menurut Bergey’s edisi terbaru, Lactobacillus sp. memiliki karakteristik gram +, batang (coryneform, umumnya berantai pendek), non-motil, fakultatif anaerob/mikroaerofilik, katalase -, reduksi nitrat -, tidak memproduksi H₂S, dapat memproduksi asam dari maltosa, Voges Proskauer +. Sedangkan L. casei memiliki perbedaan dari saudaranya; dapat tumbuh pada suhu 15⁰C dan tidak membentuk gas dari glukosa. Lalu untuk sifat Shirota strain-nya mungkin itu merupakan rahasia perusahaan yang menjadikannya selamat melewati asam lambung.

Kultur muda lebih baik digunakan untuk pewarnaan gram, jangan langsung dari kemasan. Setelah umur 3 hari akan tampak koloni kecil-kecil seperti tampak pada gambar (umur 24 jam koloni belum terlihat karena tumbuh dalam keadaan aerob) dan siap digunakan sebagai kontrol.

Pengecekan karakteristik lain dapat dilakukan sebelum pewarnaan gram, hanya untuk mengkonfirmasi saja. Untuk mudahnya dilakukan uji karakteristik yang tidak memakan waktu seperti bentuk sel, katalase, motilitas dan uji gram dengan KOH 3%.

Hasil dari penegecekan (telah dilakukan) tersebut seharusnya adalah:
-Sel berbentuk batang, ada yang bengkok beberapa berantai pendek.
-Sel non motil, dapat diamati adanya gerak brown pada perbesaran 1000X.
-Katalase - , untuk memastikannya supaya jelas antara gelembung dan kumpulan sel yang mengambang, slide diamati pada perbesaran 40X.
-Uji gram dengan KOH 3% menunjukkan tidak adanya lendir dengan jelas.
kontrol dari kegiatan ini adalah E. coli non-motil yang membuktikan senyawa-senyawa yang digunakan dalam keadaan baik dan dengan metode yang benar.
(http://ekmon-saurus.blogspot.com/2009/05/bakteri-kontrol-harga-murah-untuk.html) Selasa, 22-12-2009

Bentuk

Bentuk tubuh atau morfologi bakteri dipengaruhi oleh keadaan lingkungan, medium dan usia. Oleh karena itu untuk membandingkan bentuk serta ukuran bakteri, kondisinya harus sama. Pada umumnya bakteri yang usianya lebih muda ukurannya relatif lebih besar daripada yang sudah tua. Berdasarkan bentuknya, bakteri dibagi menjadi tiga bagian besar,yaitu berbentuk kokus, basilus, dan spirilum.

Kokus

Sel bakteri yang berbentuk seperti bola atau elips dinamakan kokus. Kokus muncul dalam beberapa penataan yang khas bergantung pada spesiesya dan mempunyai beberapa variasi sebagai berikut:

Mikrococcus, jika kecil dan tunggal (single)
Diplococcus, jka bergandanya dua-dua
Pneumococcus, diplococcuss yang berbentuk lanset, gonococcus adalah diplokokus yang berbentuk biji kopi.
Tetracoccus, jika bergandengan empat dan membentuk bujur sangkar
Sarcina, jika bergerombol delapan sel yang tersusun rapi dalam bentuk kubus
Staphylococcus, jika bergerombol tak teratur seperti ntaian buah anggur
Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai

2. Basilus

Sel bakteri berbentuk silindris atau seperti batang dengan panjang bervariasi dari 2-10 kali diameter kuman tersebut dinamakan basilus. Bakteri ini mempunyai variasi sebagai berikut:

Ø Cocobacillus, batang yang sangat pendek menyerupai kokus

Ø Fusiformis, dengan kedua ujung batang meruncing

Ø Streptobacillus, sel-sel bergandengan membentuk suatu filamen

Ada banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus. Perbedaan-perbedaan tersebut tampak pada bakteri-bakteri berikut ini:

Clostridium sporogenes, 0,6-0,3 µm x 3,0-7,0 µm
Pseudomonas sp., 0,5-1,0 µm x 2,0-3,0 µm
Bacillus megaterium, 0,2-1.5 µm x 2,0-4,0 µm
Salmonella typhi, 0,6-0,7 µm x 2,0-3,0 µm

Ujung beberapa basilus tampak persegi, yang lain bundar, dan yang lain lagi meruncing atau lancip seperti ujung cerutu. Kadang-kadang basilus tetap saling melekat satu dengan yang lainnya, ujung dengan ujung, sehingga memberikan penampilan rantai.

3. Spiral

Bakteri berbentuk spiral, atau spirilum, terutama dijumpai sebagai individu-individu sel yang tidak saling melekat. Spiril adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi sebagai berikut:

Vibrio, berbentuk batang bengkok
Spirilum, berbentuk spiral kasar dan kaku, tidak fleksibel dan dapat bergerak dengan flagel
Spirochaeta, berbentuk spiral halus, elastik, dan fleksibel, dapat bergerak dengan aksial filament

Contoh:

Borrelia, berbentuk gelombang
Treponema, berbentuk spiral halus dan teratur
Leptospira, berbentuk spiral dengan kaitan pada satu atau kedua ujungnya.

Ukuran

Satuan ukuran bakteri ialah mikrometer (µm), yang setara dengan 1/1000 mm atau 10^-3mm. bakteri yang paling umum di pelajari di dalam praktikum mikrobiologi dasar berukuran kira-kira 0,5-1,0 x 2,0-5,0 µm. Sebagai contoh bakteri stafilokokus dan streptokokus yang berbentuk bola mempunyai diaeter yang berkisar dari 0,75 sampai 1 µm dan panjang 2 sampai 3 µm. sel beberapa spesies bakteri amat panjang; panjangnya dapat melebihi 100 µm dan diameternya berkisar dari 0,1 sampai 0,2 µm. sekelompok bakteri yang dikenal sebagai mikoplasma, ukurannya khas amat kecil, sedemikian kecilnya sehingga hamper-hampir tak tampak di bawah mikroskop cahaya. Mereka juga pleomorfik; yaitu morfologinya amat beragam. Ukurannya berkisar dari 0,1 sampai 0,3 µm.

Walaupun bakteri amat kecil ukurannya, namun dapat diukur dengan relatif mudah secara tepat. Untuk tujuan ini, mikroskop dilengkapi dengan micrometer ocular, suatu piringan yang diukir garis-garis berjarak sama. Jarak antara garis-garis tersebut ditentukan sebelumnya dengan berpedomakan mikrometer pentas, suatu alat yang berfungsi sebagai mistar pada kerja mikroskopis. Pemeriksaan bakteri melalui mikroskop yang dilengkapi dengan mikrometer ocular akan menampakkan garis-garis yag sudah diketahui ukurannya di atas mkroorganisme yang diperiksa sedemikian rupa sehingga panjang dan lebar sel dapat ditentukan dengan mudah.

Memang sukar untuk memahami bakteri yang ukurannya sangat kecil itu dari segi kuantitatif seerti disebutkan di atas. Contoh-contoh berikut mungkin dapat membantu. Suatu volume sebanyak 1 cm³ mengandung sekitar setengah riliyun bakteri berbentuk batang berukuran rata-rata.kalulasi menunjukkan bahwaa kira-kira satu triliun bakteri mempunya berat hanya 1 g. Paling banyak bakteri diperiksa pada perbesaran 1.000 kali; lalat rumah yang umum bila diperbesar dengan taraf yang sama akan tampak lebih dari 9 m panjangnya.

Ciri khusus sel bakteri akan terungkap bila perbandingan antara luas permukaan terhadap volumena dihitung. Bagi bakteri, nilai ini sangat tinggi dibandingkan dengan mikroorganisme yang lebih besar. Dari segi praktis hal ini berarti bahwa isi suatu selbakteri menjadi terbuka terhadap batas permukaan antara dinding sel dannutrien di sekitarnya. Sifat inilah yang merupakan salah satu penyebab tingginya laju metabolism dan pertumbuhan bakteri.

Adapun pengukuran sel bakteri dapat ditempuh dengan langkah-langkah berikut ini:

Mikrometer pentas diletakkan di atas pentas mikroskop dan diamati di bawah objektif berkekuatan rendah.
Mikrometer ocular selanjutnya disisipkan di dalam lensa mata mikroskop. Bila dilihat di bawah objektif celup minyak (berkekuatan tinggi), maka skala mikrometer okular berimpit (atas) dengan skala mikrometer pentas (bawah). Pembagian skala pada mikrometer okular dikalibrasi dengan cara membandingkannya dengan mikrometer pentas.
Mikrometer okular yang sudah dikalibrasi digunakan untuk mengukur sel bakteri.

Warna

Untuk mempelajari morfologi, struktur, sifat-sifat bakteri dalam membantu mengidentifikasinya, kuman perlu diwarnai.

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dapat dilihat pada table berikut ini:

Bakteri Gram-positif yang berbentuk kokus, kecuali kokus dari famili Neisseriaceae bersifat patogen terhadap manusia, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Demikian juga halnya dengan spesies bakteri Gram-negatif yang berbentuk batang dan spiral, kecuali batang yang berasal dari genus: Mycobacterium, Corynebacterium, Listeria, Bacillus, dan Clostridium. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).

Bau

Setiap bakteri memiliki bau yang khas, misalnya bau busuk yang berasal dari tubuh mayat. Pembusukan dimulai dengan pemutusan ikatan protein-protein besar pada jaringan tubuh oleh bakteri fermentasi menggunakan enzim protease. Kumpulan hasil pemutusan ikatan protein yang disebut asam amino ini dicerna berbagai jenis bakteri, misalnya bakteri acetogen. Bakteri ini mereaksikan asam amino dengan oksigen dalam tubuhnya untuk menghasilkan asam asetat, hidrogen, nitrogen, serta gas karbon dioksida. Produk asam asetat ini menimbulkan bau.

Asam asetat yang dihasilkan ini diproses kembali oleh bakteri jenis methanogen, misalnya Methanothermobacter thermoautotrophicum yang biasa hidup di lingkungan kotor seperti selokan dan pembuangan limbah (septic tank). Asam asetat direaksikan dalam sel methanogen dengan gas hidrogen dan karbon dioksida untuk menghasilkan metana, air, dan karbon dioksida. Metana dalam bentuk gas juga menghasilkan bau busuk.

Selain asam asetat dan gas metana, beberapa bakteri menghasilkan gas hidrogen sulfida yang baunya seperti telur busuk. Lebih dari itu, bau busuk mayat di lautan yang bercampur dengan uap garam dapat bersifat racun, karena mampu mereduksi konsentrasi elektrolit dalam tubuh.

Produk berbahaya selain gas yang dihasilkan adalah cairan asam dan cairan lain yang mengandung protein toksik. Jika cairan-cairan ini sempat menginfeksi kulit yang luka atau terkena makanan, bukan hanya produk beracun yang dapat masuk ke dalam tubuh tetapi juga bakteri heterotrof patogen seperti Clostridium sp.

Bakteri serta produk beracun ini dapat menginfeksi manusia lewat kontaminasi makanan, minuman, atau luka di kulit. Karena adanya saluran masuk ini, maka berbagai penyakit seperti malaria, diare, degradasi sel darah merah, lemahnya sistem pertahanan tubuh, infeksi pada luka (tetanus), bengkak, atau infeksi pada alat kelamin menjadi ancaman yang serius.

Cara mengatasi serangan mikroorganisme ini adalah dengan menjaga makanan dan minuman tetap steril, yaitu dengan dipanaskan. Mencuci tangan dan kaki dengan sabun antiseptik cair sebelum makan. Menjaga lingkungan agar steril dengan cara menyemprotkan obat pensteril. Bakteri-bakteri tersebut juga dapat dicegah pertumbuhannya dengan cara meminum obat antibiotik atau suntik imunitas

Bentuk “Smooth” dan “Rough”

Bakteri memiliki permukaan yang berbeda-beda dan bergantung pada elevasi dari bakteri tersebut.Untuk bakteri yang memiliki flat elevation ( datar), maka bentuk permukaan dari bakteri tersebut adalah smooth dan glistening, sedangkan untuk bakteri yang memiliki raised elevation, bentuk permukaannya adalah rough (kasar). Contoh dari koloni bakteri yang memiliki bentuk permukaan smooth adalah Eschericia coli dan contoh koloni bakteri yang memiliki bentuk permukan rough adalah B.subtilis.

Mikroskopi

Mikroskopi adalah ilmu yang mempelajari benda kecil dengan menggunakan mikroskop. Mikroskop berasal dari bahasa Yunani yang terdiri dari kata “micron” yang artinya kecil dan “scopos” yang artinya tujuan. Mikroskop adalah sebuah alat yang digunakan untuk melihat objek yang terlalu kecil apabila dilihat dengan menggunakan mata telanjang. Dengan menggunakan mikroskop, memungkinkan prbesaran objek hingga ratusan ribu kali. Instrumen ini paling banyak digunakan di Laboratorium mikroskopi.

Jenis Mikroskop

Mikroskop terdiri dari dua jenis, yaitu:

Mikroskop Cahaya

Mikroskop cahaya dikenal juga dengan nama “Compound light microscope” adalah sebuah mikroskop yang menggunakan cahaya lampu sebagai pengganti cahaya matahari, sebagaimana yang digunakan pada mikroskop konvensional. Pada mikroskop konvensional, sumber cahya masih berasal dari sinar matahari yang dipantulkan dengan suatu cermin datar atau cermin cekung yang terdapat dibawah kondensor. Cermin ini akan mengarahkan cahaya dari luar ke dalam kondensor.

Mikroskop cahaya menggunakan tiga jenis lensa, yaitu lensa objektif, lensa okuler, dan kondensor. Lensa objektif dan lensa okuler terletak pada kedua ujung tabung mikroskop, sedangkan penggunaan lensa okuler terletak pada mikroskop bisa berbentuk lensa tunggal (monokuler) atau ganda (binokuler). Pada ujung bawah mikroskop terdapat tempat dudukan lensa objektif yang bisa dipasangi tiga lensa atau lebih. Di bawah tabung mikroskop terdapat meja mikroskop yang merupakan tempat preparat.

Lensa mikroskop cahaya mempunyai fungsi masing-masing. Lensa objektif berfungsi untuk membentuk bayangan pertama, menentukan struktur yang akan terlihat pada bayangan akhir, serta memperbesar bayangan objek. Lensa okuler adalah lensa mikroskop yang terdapat dibagian ujung atas tabung berdekatan dengan mata pengamat, berfungsi untuk memperbesar bayangan yang dihasilkan oleh lensa objektif berkisar antara 4 hingga 25 kali. Sistem lensa ketiga adalah lensa kondensor yang berfungsi untuk mendukung terciptanya pencahayaan pda objek yang akan dilihat.

Mikroskop cahaya terbagi menjadi:

Mikroskop Medan Terang

Medan mikroskop dalam mikroskop medan-terang, diterangi dengan benderang, sehingga objek yang sedang diamati tampak lebih gelap daripada latar belakangnya. Mikroskop medan-terang menghasilkan perbesaran maksimum sekitar 1000 diameter, akan tetapi perbesaran ini dapat ditingkatkan dengan sedikit modifikasi.

Mikroskop Medan Gelap

Pada mikroskop medan-gelap, diperlengkapi dengan kondensor medan-gelap dan suatu objektif ber-NA rendah. Kondensor ini mengarahkan berkas cahaya ke dalam medan spesimen pada sudut yang sedemikian hingga hanya berkas-berkas yang mengenai objek pada medan spesimen itu dibiaskan dan memasuki objektif. Akibatnya, objek itu menjadi terang-benderang dan sangat nyata terhadap medan-gelap. Mikroskop medan-gelap berguna untuk pemeriksaan mikroorganisme hidup. Teknik ini sangat berguna bagi identifikasi bakteri yang menyebabkan sifilis.

Mikroskop Fluoresensi

Mikroskop fluoresensi banyak ditemukan di Laboratorium Rumah Sakit dan Klinik. Mikroskop ini digunakan untuk memeriksa specimen yang telah diwarnai dengan zat-zat pewarna fluorokrom, sehingga memungkinkan identifikasi mikroorganisme denagn cepat. Zat-zat pewarna ini menyerap energi gelombang cahaya pendek tak kasat mata sambil memancarkan gelombang panjang gelombang kasat mata yang lebih besar. Bahan seperti itu disebut fluoresen, sehingga fenomena ini disebut fluoresensi (pendar fluor).

Mikroskop Kontras Fase

Mikroskop kontras fase merupakan mikroskop cahaya yang memungkinkan kontras yang lebih besar antara substansi dengan berbagai ketebalan atau indeks bias. Hal ini dapat di peroleh dengan menggunakan kondensor dan objektif yang khusus yang mengendalikan iluminasi objeknya dengan jalan mengaksentuasikan perbedaan-perbadaan yang kecil dalam ketebalan atau indeks bias struktur-struktur selular. Perbedaan tersebut dapat dilihat dari terang atau gelap yang berlainan. Dengan teknik ini dapat ditemukan letak struktur di dalam sel yang tidak diwarnai dan tak teramati dengan mikroskop medan-terang.

Mikroskop Elektron

Mikroskop elektron adalah sebuah mikroskop yang mampu melakukan pembesaran objek sampai dua juta kali yang menggunakan elektro statik dan elektro magnetik untuk mengontrol pencahayaan dan tampilan gambar, serta memiliki kemampuan pembesaran objek serta resolusi yang jauh lebih bagus daripada mikroskop cahaya. Mikroskop elektron ini menggunakan lebih banyak energi dan radiasi elekromagnetik yang lebih pendek dibandingkan dibandingkan mikroskop cahaya.

Mikroskop elektron terbagi menjadi beberapa jenis, yaitu:

Mikroskop Transmisi Elektron (TEM)

Mikroskop transmisi electron (Transmission Electron Microscope- TEM) adalah sebuah mikroskop elektron yang cara kerjanya mirip dengan cara kerja proyektor slide, dimana elektron ditembuskan ke dalam objek pengamatan dan pengamat mengamati hasil tembusannya pada layer. Mikroskop ini telah mengalami peningkatan kinerja hingga mampu menghasilkan resolusi hingga 0,1 nm.

Mikroskop Pemindai Transmisi Elektron (STEM)

Mikroskop pemindai transmisi elektron (STEM) merupakan salah satu tipe yang merupakan hasil pengembangan dari mikroskop transmisi elektron (TEM). Pada sistem STEM ini, elektron menembus spesimen, namun sebagaimana halnya dengan cara kerja SEM.

Mikroskop Pemindai Lingkungan Elektron (ESEM)

Mikroskop ini merupak pengembangan dari SEM yang dalam bahasa Inggrisnya disebut Environtmental SEM (ESEM) yang dikembangkan guna mengatasi objek pengamatan yang tidak memenuhi syarat sebagai objek TEM maupun SEM.

Pemeriksaan Bakteri Hidup

Pemeriksaan bekteri hidup harus dikerjakan dengan hati-hati, lebih-lebih jika yang akan diperiksa itu bakteri patogen. Untuk mengetahui tingkah laku (gerak-gerik) bakteri, kita adakan penyelidikan bakteri didalam “tetesan bergantung”. Alat-alat yang kita gunakan untuk ini adalah:

· Cover glass yang bersih

· Object glass yang mempunyai cekungan di tengahnya

· Kawat inokulasi yaitu kawat lurus sepanjang ± 10 cm berdiameter ± 0.5mm dan menancap pada suatu pegangan. Guna kawat inokulasi yaitu memindahkan mikroorganisme dari tempt yang satu ketempat yang satu.

· Sebuah mikroskop biasa

· Pembakar spirtus, untuk memijarkan kawat dan mulut tabung reaksi

(Prof. Dr. D. Dwidjoseputro. 1998:2)

Prosedur Menyiapkan Sediaan (Preparat)

Dua teknik umum digunakan untuk menyiapkan material/spesimen untuk pemeriksaan mikroskop yaitu :

o Suspensi organisme dalam suatu cairan

o Menggunakan lapisan tipis/ olesan spesimen yang dikeringkan, difiksasi dan di amati.

a) Teknik lekupan basah dan tetes gantung

Preparat basah/tetes gantung memungkinkan pemeriksaan organisme hidup yang tersuspensi dalam zat alir. Preparat basah diperoleh dengan menaruh setetes zat alir yang mengandung organisme hidup yang pada kaca object dan menutupnya dengan kaca yang sangat tipis/cover glass. Untuk mengurangi laju penguapan dan peniadaan aliran udara, tetesan itu biasanya dilingkari dengan “jel portelium”atau bahan serapan sehingga antara kaca object dan cover glass tertututp rapat.Tersedia kaca object khusus dengan daerah cekung ke dalam untuk preparat tetes gantung. Preparat basah/tetes gantung berguna apabila mikroorgaisme yang telah diperiksa dapat rusak karena perlakuan dengan panas/ bahan kimia ataupun bila organisme itu suka diwarnai. Cara ini pun merupakan metode piihan untuk mengurangi proses-proses kehidupan tertentu seperti molilitas dan morfologi.

Apabila preparat basah diperiksa dengan mikroskop medan-terang amatlah penting untuk menyesuaikan sumber cahayanya dengan benar. Intensitas cahaya dapat dikurangi dengan menggunakan filter khusus. Mikroskop medan-gelap dan mikroskop kontras fase memberikan keuntungan khusus untuk pemeriksaan sel-sel mikroba yang tidak diwarnai yang tersuspensi dalam zat cair; kedua macam mikroskop menghasilakan kontras yang lebih baik antara mikroorganisme dan bahan latar belakangnya. Teknik ini digunakan dilaboratorium diagnosisi klimis, khususnya untuk pemeriksaan spesimen yang diduga mengandung protozoa didalamnya. Sel protozoa pada umumnya lebih besar dari pada ke banyakan bakteri dan mempunyai struktur internal yang lebih rumit. Bagian intraseluler penting untuk mencirikan spesies dan dapat di amati dengan menggunakan mikroskop medan-gelap/kontras fase.(Michael J. Pelezar, jr; E.C.S. Chan.2006:6)

Keuntungan penggunaan metode tetes gantung yaitu :

§ Bakteri ada terkurung di dalam tabung kaca benda, sehingga tak terjadi perjangkitan

§ Bakteri dapat bergerak dengan leluasa, jika bekteri memang suka bergerak, tak semua spesies dapat bergerak.

Cara lain untuk memeriksa bakteri hidup adalah dengan tetesan medium yang tidak bergantung. Prosedurnya lebih mudah dan untuk itu tidak diperlukan object glass yang mempunyai kecekungan ditengah. Ujung kawat yang membawa bakteri disentuhkan ditengah-tengah object glass kemudian tetesan itu dibentuk dengan cover galss, maka jadilah suatu preparat yang siap untuk diperiksa. Preparat yang disediakan demikian ini kurang aman, lagi pula bakteri tidak bebas untuk bergerak. (Prof. Dr. D. Dwidjoseputro. 1998:14)

Membuat Preparat Bakteri yng Sudah Dimatikan

Sediakan object glass yang bersih. Ambillah sedikit sampel dari bakteri yang diperiara dalam medium cair atau dari suatu koloni yang terdapat pada suatu medium padat. Pengambilan ini dilakukan dengan menggunakan ujung kawat inokulasi seperti telah dibentangkan didepan. Geskan ujung kawat yang membawa bakteri itu ditengah-tengah object glass sehingga terjadi suatu pembidangan seluas kira-kira 1 cm. jika sikap ujung kawat itu diusahakan agak sejajar dengan permukaan object glass. Maka penggesekan akan lebih mudah dan lebih merata; bakteri tidak akan bertimbun-timbun pada tempat tertentu. Jika sampel tadi di ambil dari suatu koloni pada medium padat maka tengah-tengah object glass harus diberi sedikit air murni dulu sebelum penggesekan dilakukan. Air itu tak perlu di berikan, jika sampel bakteri di ambil dari piaraan yang berada dalam sediaan cair.

Tunglah sampai gesekan agak kering, kemudian lewatkan object glass itu melalui suatu nyala api, perlahan-lahan sampai gesekan itu kering. Di dalam hal ini haruslah dijaga supaya tempat gesekan bakteri tak langsung kena api, jagi permukaan yang mengandung gesekan haruslah diatas pada waktu object glass dilewatkan nyala api.

Jikan gesekan bektei sudah kering benar, dapat di mulai dengan pewarnaan bakteri. Metode mewarnai/ mengecet preparat itu banyak sekali, akan tetapi hanya kira-kira 12 cara sejalan yang lazimnya digunakan pewarnaan. Ini akan di bahas lebih lanjut dalam praktik berikutnya. (Prof. Dr. D. Dwidjoseputro. 1998:15)

Alat dan Bahan :

Alat-alat :

§ Object glass

§ Pembakar spirtus

§ Jarum ose

§ Kertas saring

Bahan-bahan :

§ Kapas

§ Pewarna fuchin/sefranin, gentian violet dan methylene blue

§ Larutan iodium/lugol

§ Biakan induk (bacillus sublitis dan sarcina)

§ Alkohol 95% atau 70%

§ Aquades atau air

Prosedur Kerja :

Preparat bakteri yang telah dibuat pada praktikum materi 2a

Preparat diberi pewarna awal gentian violet selama 30 detik

Preparat dibilas dengan aquades

Preparat diberi larutan lugol/iodium selama 30 detik

Preparat dibilas dengan aquades

Preparat warnanya dihilangkan dengan manambah larutan alkohol 95% selama 15 detik

Preparat warnai kembali dengan zat warna yaitu fuchin/sefranin selama 30 detik

Preparat dibilas dengan aquades

Kelebihan air dihilangkan dengan kertas tissue

Preparat bakteri yang sudah siap, di amati dibawah mikroskopo majemuk dengan pembesaran lensa objek 100 kali yang telah ditetesi minyak imersi . gram positif berwarna ungu dan gram negative berwarna merah

Bakteri yang telah terlihat di amati dan di gamabar

Hasil

Setelah melakukan praktik pembuatan preparat dii peroleh hasil sebagi berikut:

ü Semua alat-alat yang digunakan telah steril dan siap untuk digunakan

ü Preparat yang dibuat berhasil dan sesuai dengan prosedur.

ü Bakteri yang di amati bacillus sublitis dan sarcina berbentuk batang dan bulat dan di amati dibawah mikroskop majemuk dan memiliki warna sesuai dengan warna yang diberi

ü Hasil lewat gambar

Prosedur kerja yang dilakukan

Pastikan isolat yang akan diuji adalah kultur murni, benar-benar murni dan telah yakin tentang kemurniannya. Jadi jika diperoleh suatu kultur murni dari suatu lingkungan dan diyakini belum murni maka haruslah diisolasi ulang, maksudnya dimurnikan lagi sampai benar-benar pasti. Lihat gambar berikut :

Yang perlu digambar adalah koloni tunggal, bukan koloni yang besar.jika menginginkan hasil lebih bagus sebaiknya pakai kamera dijital. Biasanya koloni tunggal itu kecil-kecil dengan satuan mm. Jadi beberapa saran untuk menggambar koloni yaitu:

Cari koloni tunggal lalu gambar hati-hati dengan pensil (sebaiknya dengan skala 1:1) tanpa perbesaran. Gambar dengan mata telanjang.
Gambar koloni lebih detail dengan mikroskop stereo atau mikroskop cahaya. Saya sarankan untuk menggunakan mikroskop cahaya. Mula-mula dengan perbesaran 4X10. jika menggunakan mikroskop cahaya penempatan cawan di meja benda harus hati-hati. Perlu digambar tampak atas dan bawah cawan. Jika menginginkan perbesaran yang lebih tinggi dapat digunakan perbesaran 10X10, tapi jangan sampai lensa mengenai media atau biakan.

Pembahasan

Sebelum malakukan pewarnaan terlebih dahulu kita membuat preparat bakteri seperti yang telah kita lakukan sebelumnya pada praktikum yang lalu. Tetapi bedanya, pada praktikum yang dulu kita tak memberi pewarna sedangkan pada praktikum kali ini kita memberi pewarna tertentu yaitu fuchin, gentian violet dan methylene blue.

Sebelum itu jarum ose dipijarkan dan didinginkan, kemudian mengambil bakteri dari sumber yang sudah disediakan (sumber bakteri yang disterilkan), jarum ose tak boleh kena api karena dikhawatirkan bakteri akan mati. Mulut tabung reaksi yang berisi bakteri yang diternakkan, harus dipanaskan dengan nyala api setelah penyumbat di ambil dan setelah pengambilan bakteri selesai dan penumbat ditutup kembali. Sebelum meletakkan bakteri ke object glass, object glass harus dalam keadaan steril (disterilkan dengan alkohol 95% menggunakan kapas) baru bakteri diletakkan di object galss. Setelah itu sebelum dan sesudah dipakai kawat ose harus dipijarkan begitu juga dengan mulut tabung reaksi. Hal tersebut merupakan teknik septik. Setelah itu object glass yang sudah ada bakterinya ditambah dengan 1 tetesi aquades agar bakteri yang ditempel tersebar tapi hanya dibagian tengah saja. Air yang berlebih diserap dengan kertas isap, kemudian di angin-anginkan di atas api bunsen yang disebut fiksasi. Bertujuan untuk mempercepat kekeringan preparat, serta agar mikroba mati serta mudah di amati karena sudah menempel pada object glass sehingga tak mudah lepas, kemudia secara bertahap di lakukan pewarnaan setelah itu bakteri siap di amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100X.

Pengamatan bakteri dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya dikenal juga dengan nama “Compound light microscope” adalah sebuah mikroskop yang menggunakan cahaya lampu sebagai pengganti cahaya matahari, sebagaimana yang digunakan pada mikroskop konvensional. Pada mikroskop konvensional, sumber cahya masih berasal dari sinar matahari yang dipantulkan dengan suatu cermin datar atau cermin cekung yang terdapat dibawah kondensor. Cermin ini akan mengarahkan cahaya dari luar ke dalam kondensor. Sabtu, 28-11-2009. (http://filzahazny.wordpress.com/2008/02/16/pengantar-tentang-bakteri/)

Hasil pengamatan berupa bakteri berbentuk batang dan bulat lalu di gambar/difoto untuk di gunakan sebagai hasil gambar untuk laporan. Praktik kali ini diberi pewarna untuk dapat dibedan mana bakteri penyerap warna mana yang tidak. Bakteri yang di amati Antara lain :