PERCOBAAN VIII KINETIKA ENZIM KATALASE

VIII.1 PENDAHULUAN

            Enzim adalah golongan protein yang paling banyak terdapat dalam sel hidup dan mempunyai fungsi penting sebagai katalisator reaksi biokimia yang secara kolektif membentuk metabolisme perantara (intermediary metabolism) dari sel.

            Enzim yang mempunyai gugus bukan protein (holoenzim) termasuk golongan protein majemuk, terdiri atas protein (apoenzim) dan suatu gugus bukan protein yang dinamakan kofaktor. Yang terikat kuat dinamakan gugus prostetik, yang tidak begitu kuat ikatannya disebut koenzim.

            Suatu enzim bekerja secara khas terhadap suatu substrat tertentu. Kekhasan terhadap suatu reaksi disebut kekhasan reaksi, yang disebabkan oleh apoenzim. Enzim mempunyai derajat kekhasan yang tinggi dan dapat menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia.

            Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim :

1.    Konsentrasi Enzim

Kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim.

2.    Konsentrasi Substrat

Dengan konsentrasi enzim yang tetap, maka pertambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi. Pada batas konsentrasi tertentu, tidak terjadi kenaikkan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi substrat diperbesar.

3.    Suhu

Pada suhu rendah, reaksi kimia berlangsung lambat. Pada suhu tinggi reaksi berlangsung lebih cepat. Kenaikan suhu dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi. Kenaikan suhu sebelum terjadinya proses denaturasi dapat menaikkan kecepatan reaksi. Kenaikan suhu pada saat mulai terjadinya proses denaturasi akan mengurangi kecepatan reaksi. Titik optimum yaitu suhu yang paling tepat bagi suatu reaksi yang menggunakan enzim tertentu.

4.    Pengaruh pH

Struktur ion enzim tergantung pada pH lingkungannya. pH lingkungan akan berpengaruh pada efektivitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim substrat. pH rendah atau pH tinggi dapat menyebabkan proses denaturasi dan akan mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim. pH optimum adalah daerah pH yang menyebabkan kecepatan reaksi paling tinggi.

Read more »

PERCOBAAN VII INDUKSI b-GALAKTOSIDASE

VII.1 PENDAHULUAN

            Pengendalian metabolism pada dasarnya adalah pengendalian aktivitas atau sintesis enzim-enzim kunci pada jalur metabolism. Salah satu contoh klasik pengendalian sintesis enzim adalah lac-operon.

            Pada system ini produksi b-galaktosidase (lactase) diinduksi oleh adanya laktosa dalam medium pertumbuhan.

            Dalam percobaan ini, akan dilakukan induksi dan pengukuran aktivitas b-galaktosidase. ONPG digunakan sebagai pengganti laktosa. Setelah perusakan membrane sel oleh toluene, ONPG yang tidak berwarna ditambahkan dan berdifusi ke dalam sel. Adanya aktivitas b-galaktosidase ditunjukkan adanya perubahan warna (menjadi kuning) dari ONP.

VII.2 PERCOBAAN

Alat:

1.      Tiga buah tabung reaksi bertutup

2.      Jarum ose

3.      Pipet ukur 1 mL

4.      Pipet tetes

5.      Gelas ukur 5 mL

6.      Rak tabung reaksi

7.      Filler

8.      Pembakar spiritus

9.      Water bath

10.   Hair dryer

11.   Spektofotometer

12.   Goggles

Read more »

PERCOBAAN VI UREASE

VI.1 PENDAHULUAN

            Penentuan kadar urea (ureum) di dalam urine atau cairan lainnya, dapat dilakukan secara enzimatik dengan urease di dalam alat Conway. Urea (ureum) akan diubah menjadi ammonium karbonat. Dari ikatan ini dapat dibebaskan amonianya, dengan penambahan alkali. Ammonia yang bebas akan berdifusi ke cawan-cawan yang berisi larutan asam borat, sehingga terikat menjadi ammonium tetraborat. Kemudian campuran ini dititrasi dengan asam sulfat atau asam klorida dengan indicator Tashiro, sehingga akhirnya dapat ditentukan kadar ureanya (ureumnya).

VI.2 PERCOBAAN

Alat:

1.      Mikroburet (ujungnya disambung dengan pipa gelas yang mempunyai pipa kapiler)

2.      Alat Conway

3.      Batang pengaduk

Bahan:

1.      Ekstrak urease

45 gram kedele yang telah bersih direndam dalam air di lemari es semalam, tambahkan 75 mL air dan 225 mL gliserin, diblender selama 4 menit. Kemudian saring dengan kain dan cairan disaring melalui kertas saring lipat di lemari es. Filtrate disimpan di lemari es.

2.      Urine

Yang akan dipakai diencerkan 5 – 10 kali

3.      Buffer fosfat

3 gram Na₂HPO₄ dan 2 gram KH₂PO₄ dilarutkan dalam 100 mL aquades yang mengandung 0,03 M EDTA (di-Na).

4.      Indicator Tashiro

200 mL 0,1% larutan alcohol metil-merah ditambah 50 mL 1% larutan alcohol metilen-biru.

5.      Larutan K₂CO₃ jenuh

110 gram kalium karbonat dalam 100 mL air.

6.      Larutan asam borat 2%

7.      Gliserin teknis

Gliserin diberi setetes larutan fenolftalein dan beberapa tetes larutan NaOH sampai larutan menjadi merah.

8.      HCl 0,005 N

9.      H₂SO₄ 0,005 N

Prosedur:

1.      Bagian-bagian yang nantinya akan merapat diulasi dengan gliserin-NaOH yang mengandung fenolftalein, supaya alat Conway dapat ditutup dengan rapat. Untuk satu penentuan diperlukan 4 alat Conway.

2.      Cawan titrasi A diisi dengan 1 mL larutan 2% asam borat dan 1 tetes indicator Tashiro.

3.      Dalam keadaan miring (diganjel) dengan dinding pemisahnya di sebelah bawah, ditaruh 1 mL larutan K₂CO₃ jenuh di salah satu sisi (1) dinding pemisah (B). Di sisi lainnya (2) ditaruh:

Alat Conway           I             : 0,2 mL urine

                             II            : 0,02 mL aquades

III          : 0,2 mL urine +0,5 mL larutan urease dalam buffer fosfat yang mengandung 0,03 M EDTA (di-Na).

IV          : 0,2 mL aquades + 0,5 mL larutan urease dalam buffer fosfat yang mengandung 0,03 M EDTA (di-Na).

4.      Sesudah diisi, alat-alat Conway tersebut langsung ditutup dan diklem.

5.      Alat I dan II dapat langsung dikerjakan dengan mencampurkan kedua cairan yang terdapat di kedua bagian. Ini bisa dilakukan dengan mengalirkan cairan dari satu ke lain bagian dengan memberi kedudukan condong memutar.

6.      Conway-unit diletakkan mendatar selama 2 jam pada suhu kamar atau 1 jam pada suhu 37°C, sambil sekali-kali memutarnya.

7.      Setelah 15 menit dari waktu pengisian urease, alat III dan IV dapat dikerjakan sama seperti I dan II.

8.      Sekarang semua cawan titrasi dititrasi dengan H₂SO₄ atau HCl dengan normalitas 0,005 N sampai timbul warna violet muda yang tetap dengan memakai mikro-buret.

Perhitungan

Selisih hasil titrasi antara I dan II akan menunjukkan amoniak yang ada dalam urine.

Selisih antara III dan IV akan menunjukkan jumlah amoniak setelah kerja urease.

Selisih antara kedua harga tersebut akan menunjukkan banyaknya amoniak yang berasal dari urea (ureum).

Catatan

1.      Alat Conway harus bersih benar-benar.

2.      Larutan urease dibuat segar dengan mencampurkan 1 mL ekstrak urease dan 1 mL buffer fosfat dan diencerkan dengan aquades sampai 5 mL.

Tugas

Tentukan kadar urea (ureum) di dalam urine dengan menggunakan Alat Conway!

VI.3 TUGAS PENDAHULUAN

1.      Apa yang dimaksud dengan:

a.     Urea

b.    Urease

c.     Urine

2.      Dari zat-zat metabolit apa urea (ureum) terbentuk? Tuliskan reaksi kimianya!

3.      Jelaskan metode lain yang dapat digunakan untuk menentukan ureum secara kuantitatif!

Read more »

PERCOBAAN V PENENTUAN TRANSAMINASE GLUTAMAT-PIRUVAT DARI SERUM DARAH

V.1  PENDAHULUAN

            Dalam metabolism asam amino, gugus α-amino dari ke-20 asam L-amino yang biasa dijumpai pada protein akan dipindahkan pada tahap tertentu dalam degradasi oksidatif asam amino tersebut. Pemindahan gugus α-amino dari kebanyakan asam L-amino dikatalisa oleh enzim yang disebut transaminase atau aminotransferase. Pada reaksi ini, gugus α-amino dipindahkan secara enzimatik ke atom karbon α pada α-ketoglutarat, sehingga dihasilkan asam  α-keto, sebagai analog dengan asam amino yang bersangkutan. Reaksi ini juga menyebabkan aminasi  α-ketoglutarat, membentuk L- glutamate:

Asam L-α-amino + α-ketoglutarat asam α-keto + L-glutamat

                Kebanyakan enzim transaminase bersifat spesifik bagi α-ketoglutarat sebagai molekul penerima gugus amino. Namun demikian, enzim tersebut tidak terlalu spesifik bagi substratnya, yaitu asam L-amino yang memberikan gugus aminonya. Berikut ini beberapa transaminase yang paling penting, yang dinamakan sesuai dengan molekul pemberi aminonya:

L-alanin + α-ketoglutarat  piruvat + L-glutamat

L-aspartat+ α-ketoglutarat  oksaloasetat + L-glutamat

L-leusin + α-ketoglutarat  α-ketoisokaproat + L-glutamat

L-tirosin + α-ketoglutarat  p-hidroksifenilpiruvat + L-glutamat

            Hati, ginjal, jantung dan otot-otot mengandung banyak transaminase glutamate-oksaloasetat (TGO) yang juga terkenal sebagai aspartat aminotransferase dan transaminase glutamate-piruvat (TGP) atau alanin aminotransferase. Serum dalam keadaan normal juga menunjukkan adanya aktivitas enzim tersebut, tetapi rendah. Hanya apabila ada kerusakan sel pada jaringan-jaringan tersebut maka enzim-enzim intraseluler tadi akan keluar dari sel dan masuk ke dalam darah. Kenaikan aktivitas TGO dan TGP serum dapat dijumpai pada macam-macam penyakit yang menyangkut jaringan organ-organ tertentu.

Read more »

PERCOBAAN IV PENENTUAN KADAR GLUKOSA DARAH

IV.1 PENDAHULUAN

            Untuk menentukan kadar glukosa dalam darah, protein yang ada dalam darah harus diendapkan terlebih dahulu. Sampel darah dipanaskan dengan larutan Cu²⁺ dalam suasana basa. Pada suasana basa, bentuk enediol pada glukosa menjadi dominan dan mereduksi ion kupri (Cu²⁺). Cu₂O yang terbentuk kemudian direaksikan dengan reagen arsenomolibdat yang akan memberikan warna biru (molybdenium blue). Intensitas warna diukur pada panjang gelombang 660 nm. Konsentrasi glukosa darah dapat ditentukan dengan menggunakan kurva standar.

IV.2 PERCOBAAN

Alat:

1.      Tabung sentrifuga

2.      Sentrifuga

3.      Tabung reaksi

4.      Rak tabung reaksi

5.      Gelas ukur 10 mL

6.      Pipet tetes

7.      Batang pengaduk

8.      Penangas air mendidih

9.      Spektrofotometri

10.   Kuvet

Bahan:

1.      Oxalated blood

2.      Ba(OH)₂ 0,3 N

3.      ZnSO₄ 5 %

4.      Cu-alkalis

5.      Reagen arsenomolibdat

6.      Aquades

Read more »

PERCOBAAN III HIDROLISA GLIKOGEN DENGAN ENZIM

III.1 PENDAHULUAN

            Enzim α-amilase saliva mengkatalisis hidrolisa ikatan 1,4-glikosidik yang terdapat di bagian dalam suatu molekul glikogen atau pati. Enzim α-amilase ludah manusia mengandung 1 mol Ca²⁺ per mol enzim proteinnya. Ikatan Ca²⁺ ini diperlukan dalam aktivitas enzim tersebut. Aktivitas enzim α-amilase juga memerlukan anion-anion, seperti Cl^-, Br^-, dan I^-. Hidrolisa sempurna oleh α-amilase akan tercapai jika substrat (glikogen) yang digunakan memiliki konsentrasi tak jenuh dan rendah, sedangkan enzim yang digunakannya memiliki konsentrasi yang tinggi.  

III.2 PERCOBAAN

Alat:

1.      Tabung reaksi

2.      Rak tabung reaksi

3.      Gelas ukur 10 mL

4.      Pipet tetes

5.      Neraca analitik

6.      Water bath

7.      Spektofotometri

8.      Kuvet

Bahan:

1.      Glukosa 0,25 M

2.      Glikogen

3.      K-fosfat buffer pH 6,9 25μmol

4.      NaCl 10μmol

5.      Saliva

6.      Reagen Nelson

7.      Arsenol Molibdate

Read more »